Pärast 25-päevast staatilist inkubeerimist temperatuuril 28 °C näitas *Pleurotus ostreatus* NRC620 lakaas seenekultuurikeskkonnas kõrgeimat aktiivsust. Selle ensüümi optimaalsed pH ja temperatuuri väärtused olid vastavalt 3,0 ja 70 °C. Pärast 2-tunnist inkubeerimist temperatuuril 40 °C ja 50 °C säilis ensüümi aktiivsus vastavalt 68,33% ja 59,61%. Pärast 2-tunnist inkubeerimist tsitraat-fosfaatpuhvris (pH 7,0) püsis ensüümi aktiivsus 100% juures. 10 mM MgSO₄ ja CuSO₄ lisamine suurendas ensüümi aktiivsust vastavalt ligikaudu 21% ja 35%, samas kui NaCl, MnCl₂, KCl ja CaCl₂ pärssisid ensüümi aktiivsust. ABTS-i substraadina kasutades olid *Pleurotus ostreatus* NRC 620 lakaasi kineetilised parameetrid (Km ja Vmax) vastavalt 1,99 mM ja 16 217 μmol min−1 L−1. Õunamahlaproovide ensümaatiline töötlemine vähendas oluliselt nii pH-d kui ka viskoossust ning see vähenemine korreleerus säilitusaja pikenemisega. Lakkaasiga töötlemine vähendas õunamahla fenoolide kogusisaldust veidi, kuid antioksüdantse aktiivsuse vähenemist ei täheldatud.
Viimastel aastatel on teadlased keskendunud rohelise biotehnoloogia rakendamisele toiduainetööstuses. Lakkaas on üks toiduainetööstuses kõige kasulikumaid ensüüme, mida kasutatakse sellistes valdkondades nagu mahlade töötlemine, küpsetamine, veini stabiliseerimine ja toiduainete organoleptiliste omaduste parandamine.1Paljud kõrgemad taimed ja mikroorganismid eritavad lakaasi,2ja seened, näiteks deuteromütseedid, askomütseedid ja basidiomütseedid, võivad samuti toota lakaasi.3Lakkaas (EC 1.10.3.2) on sinine oksüdaas, mis redutseerib molekulaarse hapniku veeks, kasutades süsteemi, mis koosneb kolmest erinevast vase aatomist, oksüdeerides seeläbi mitmesuguseid fenooliühendeid ja aromaatseid amiine. Puu- ja köögiviljamahlade tootmisel on ensümaatiline ja mitteensümaatiline pruunistumine kriitilise tähtsusega.4Kuna need ained mõjutavad mahla värvi, maitset ja aroomi negatiivselt, tuleb need eemaldada.5
Kõigist puuviljadest tarbitakse õunu enim nii maailmas kui ka Euroopa Liidus. 2019. aastal oli õunatoodang maailmas kolmandal kohal, ületades 87 miljonit tonni.6Õunad sisaldavad arvukalt fenoolseid ühendeid, sealhulgas flavonoide ja fenoolhappeid, näiteks kofeiinhapet ja klorogeenhapet.7Kuna õunamahla tarbitakse tavaliselt selgel kujul, kaob filtreerimisprotsessi käigus ligikaudu 50–90% fenoolkomponentidest.8Tänapäeval kipuvad tarbijad valima minimaalselt töödeldud tooteid, näiteks hägust õunamahla, milles on palju polüfenoole. Kuid oma kõrge fenoolisisalduse tõttu on seda tüüpi õunamahl eriti vastuvõtlik värvimuutusele ja tumenemisele.9Õunamahla tumenemise vähendamiseks või vältimiseks kasutatakse mitmesuguseid tehnoloogiaid, sealhulgas kuumtöötlusmeetodeid, näiteks pastöriseerimist temperatuuril 60–90 °C.10Sauceda-Gálvezi uuringute kohaselt11Termiline töötlemine võib hävitada lenduvaid kemikaale ja mõjutada õunamahla organoleptilisi omadusi. Termiliste töötlemismeetodite alternatiivideks on ülikriitiline süsinikdioksiid, ultraviolettkiirgus, ultraheli, kõrge hüdrostaatiline rõhk või kõrgsurvehomogeniseerimine.12Nende tehnoloogiate efektiivsus ja sobivate puuviljamahlade saagikus sõltuvad kasutatud parameetritest ja toote omadustest. Nende laialdast kasutamist piiravad kõrged kulud, mõnede toiduainete kvaliteedile avaldatav negatiivne mõju või ebapiisav ensüümide inaktiveerimine.13,14
Lakkaasi saab kasutada puuviljamahla stabiliseerimiseks ja selitamiseks.15Gökmen jt.16soovitavad puuviljamahla selitamiseks kasutada lakaasi, kuna see eemaldab tõhusalt fenoolühendid, muutes need polümeerideks või oligomeerideks, mida saab hõlpsasti eemaldada mis tahes ultrafiltratsioonimembraaniga, võimaldades õunamahlal säilitada stabiilset värvust ja selgust kuni kuus nädalat temperatuuril 50 °C. Puhastatud *Trichoderma* lakaas immobiliseeriti alumiiniumoksiidi helmestele ja seda kasutati õunamahla mikroobse saastumise põhjustatud maitsetute ühendite selektiivseks eemaldamiseks.17
Ligikaudu 80–90% õunamahla lenduvatest komponentidest on estrid ja aldehüüdid, mis annavad mahlale ainulaadse aroomi.18Õunamahla selitamiseks immobiliseeriti *Trametes versicolor* lakaas odavale toele, mis oli valmistatud noorte kookospähklite looduslikust kiust.19Varasemates uuringutes on uuritud õunamahla stabiliseerimist (värvus ja hägusus) ensüümivabade või immobiliseerimismeetodite abil või kombinatsioonis ultrafiltratsiooniga.5,19Seente lakaaside mõju õunamahla füüsikalis-keemilistele omadustele säilitamise ajal jääb siiski ebaselgeks. Seetõttu oli käesoleva uuringu eesmärk eksperimentaalselt uurida õunamahla füüsikalis-keemiliste omaduste, fenooliühendite sisalduse ja antioksüdantse aktiivsuse muutusi pärast töötlemist seente lakaasidega ja kahenädalast külmkapis säilitamist. Lakkaasidel on võime oksüdeerida fenooliühendeid, mis muudab need paljulubavaks kasutamiseks erinevates tööstusprotsessides, sealhulgas mahla selitamisel. Käesolevas uuringus uuriti *Pleurotus ostreatus* NRC 620 lakaase, keskendudes ideaalsetele tingimustele nende aktiivsuse ja mahla selitamisel efektiivsuse jaoks. Kuigi uuringud austerservikute (P. ostreatus NRC 620) kohta on endiselt piiratud, on varasemates uuringutes uuritud erinevatest seenallikatest, näiteks Trametes versicolor ja Ganoderma lucidum, pärit ensüüme. Käesoleva uuringu eesmärk oli hinnata selle ensüümi potentsiaalset rakendamist toiduainetööstuses ja tuua esile selle ainulaadsed omadused, eriti selle ideaalne pH ja temperatuur.
2,2′-asooksübis(3-etüülbensotiasoliin-6-sulfoonhape) (ABTS) osteti firmalt Sigma-Aldrich (Kanada). Kõik teised reagendid olid analüütilise puhtusega.
Riikliku Uurimiskeskuse mikroobikultuuride kollektsioonikeskus hankis teadaoleva austerserviku tüve NRC620. Pärast ümberkultiveerimist säilitati seda tüve kartuli-dekstroosagaril temperatuuril 4 °C. Inokulaadi ettevalmistamise meetod oli järgmine: 10-päevane, täielikult arenenud seeneniidistik inokuleeriti kartuli-dekstroosagariplaatidele ja inkubeeriti temperatuuril 28 °C. 10 päeva pärast eemaldati agarsöötmest steriilse metallpitseri abil kolm 12 mm läbimõõduga seeneniidistiku plokki ja asetati 250 ml Erlenmeyeri kolbidesse, mis sisaldasid vatitupsusid, mis sisaldasid 50 ml steriliseeritud söödet (pH 5,0, nagu on varem kirjeldanud Othman jt.).20). Kultuure inkubeeriti temperatuuril 28 °C 18 päeva. Seejärel filtreeriti kultuurid läbi Whatman nr 1 filterpaberi ja saadud supernatant toimis ensüümiallikana.
Lakkasi aktiivsust määrati, kasutades substraadina ABTS-i. Reaktsioonisegu (2 ml) sisaldas 500 μL 0,3 mM ABTS-i (lahustatuna 0,1 M naatriumtsitraatpuhvris, pH 4,5) ja vajalikku kogust destilleeritud veega lahjendatud ensüümiproovi.21,22Arvestades, et lakaas võib ABTS-i oksüdeerida toatemperatuuril (28 °C ± 2), määrati ABTS-i oksüdatsioon neeldumise suurenemise mõõtmise teel lainepikkusel 420 nm (ε420= 36 000 cm3-1 M -1) kasutades Agilent Carry-100 UV-spektrofotomeetrit. 1 μmol ABTS-i oksüdeerimiseks minutis oli vaja ühte ühikut lakaasi aktiivsust. Valgu kontsentratsioon määrati Bradfordi meetodil, kasutades sisemise kontrollina veise seerumi albumiini.23,24
Pärast ensüümi saamist austerserviku tüvest NRC 620 mõõdeti selle aktiivsust erinevate kultiveerimisintervallidega 25 päeva jooksul staatilistes tingimustes temperatuuril 28 °C.
Temperatuuri mõju uurimiseks lakaasi aktiivsusele viidi läbi katsed temperatuurivahemikus 20 kuni 90 °C. Enne ensüümi lisamist ja reaktsiooni alustamist segati puhver (0,1 M naatriumtsitraat, pH 4,5) ja substraat (ABTS) ning inkubeeriti 5 minutit erinevatel temperatuuridel. Ensüümi termilist stabiilsust hinnati inkubeerimisega 0,05 M naatriumfosfaatpuhvris (pH 7,0) vastavalt temperatuuril 40, 50, 60 ja 70 °C 2 tunni jooksul. Jääkaktiivsust hinnati seejärel ABTS substraadi abil.
pH mõju lakaasi aktiivsusele hinnati, kasutades substraadina ABTS-i 0,1 M tsitraat-fosfaatpuhvrites pH vahemikus 2,5 kuni 7,0. Ensüümilahust inkubeeriti pH stabiilsuse hindamiseks kaks tundi temperatuuril 40 °C 0,1 M tsitraat- ja Tris-puhvrites (pH 3, 4, 6 ja 7). Jääkaktiivsus ABTS-i kui substraadiga arvutati pärast inkubeerimist.
Lakkaasi inkubeeriti 10 minutit naatriumfosfaatpuhvris (0,05 M, pH 7,0), mis sisaldas erinevaid metalliioone (Mg2+, Cu2+, Co2+, Ca2+, Zn2+, K+, Na+ ja Mn2+) kontsentratsioonidel vastavalt 2,5 mM ja 10 mM. Seejärel lisati reaktsiooni alustamiseks substraat (ABTS) ja hinnati suhtelist aktiivsust.
Kineetiliste parameetrite (Vmax ja Km) määramiseks mõõdeti ABTS-i oksüdatsiooni lakaasi abil erinevatel kontsentratsioonidel (0,025–3 mM) pH 4,5 juures.konstandidMichaelis-Menteni võrrandi muutujad arvutati Lineweaver-Burki graafiku abil, mis kujutab reaktsioonikiiruse pöördväärtust substraadi kontsentratsiooni funktsioonina. Kineetilised konstandid arvutati Lineweaver-Burki graafikult, kasutades GraphPad Prism versiooni 6.01 tarkvara.
Pärast õunte põhjalikku pesemist kraaniveega lõigati need pooleks ja pressiti mahla täisautomaatse Braun MP80 õunamahlapressiga (toodetud Saksamaal). Mahl filtreeriti läbi nelja marlikihi. Kontrollrühmale ensüüme ei lisatud, samas kui värskelt valmistatud õunamahlale lisati 2,0% lakaasi (kõige efektiivsem testitud kontsentratsioon) ja seejärel hoiti mahla kaks nädalat temperatuuril 4 °C.
Tiitritav happesus (TA) ja pH määrati Boulton jt meetodil.al.27Iga proovi pH-d mõõdeti digitaalse pH-meetriga (JENWAY 3510 pH-meeter). Tiitritav happesus (TA) arvutati õunhappe põhjal järgmise valemi abil.
Kus V ja C on vastavalt tiitrimisel kasutatud naatriumhüdroksiidi lahuse maht (ml) ja kontsentratsioon (0,1 mol/l). K on õunhappe konversioonitegur, mis on võrdne 0,067-ga ja W on õunamahla mass (g).
Lahustuvate tahkete ainete koguhulk (KäibemaksukohustuslaneKõigi mahlaproovide ) sisaldus määrati PAL-1 taskurefraktomeetriga (ATAGO, Tokyo, Jaapan). Pärast iga mõõtmist loputati optiline lääts deioniseeritud veega ja iga õunamahlaproovi testiti kolm korda. Iga proovi väärtus arvutati kolme mõõtmise keskmise arvutamise teel. Iga õunamahlaproovi keskmine ± standardhälve arvutati samuti nende tulemuste keskmise arvutamise teel.
Õunamahlaproovide viskoelastsust hinnati pöörleva viskosimeetri (RV, Rheotest 2, Saksamaa) abil. Proov asetati viskosimeetri „S2“ silindrisse. Näivviskoossust esindas nihkepinge ja nihkekiiruse kõvera kalle, mis arvutati nihkepinge ja vastavate kõverate põhjal erinevatel nihkekiirustel (vahemikus 1,00 kuni 437,4 s⁻¹). Näivviskoossuse arvutamise valem on järgmine:
Kus η on näiv viskoossus (cP), τ on nihkepinge (dyn/cm²), γ on nihkekiirus (sec⁻¹) ja (τ) arvutatakse pöördemomendi (α) ja silindri (Z) väärtuste abil järgmise valemi abil: τ = Z . α.
Pruunistamisindeks määrati Meidav et al. meetodi järgi.al.2910 ml mahlaproovi tsentrifuugiti kiirusel 2750 x g 10 minutit. 5 ml mahla supernatanti segati 5 ml 95% etanooliga. Segu neeldumist mõõdeti lainepikkusel 420 nm, kasutades Shimadzu UV-spektrofotomeetrit (UV-1601 PC).
Fenoolide kogusisaldus (TPC) määrati kolorimeetriliselt, kasutades Folin-Ciocalteu reagendi, nagu on kirjeldanud Boulton jt.[27]]. Gallushappe standardkõver koostati kontsentratsioonidele vahemikus 0 kuni 500 mg/l (r²= 0,997). Tulemused on väljendatud gallushappe ekvivalentidena (mg GAE/ml).
Lisage 25 μl õunamahlale 125 μl destilleeritud vett ja 2850 μl FRAP-lahust ning jätke segu pimedasse kohta seisma.30min. Seejärel mõõtke neeldumist lainepikkusel 593 nm, kasutades Shimadzu UV-spektrofotomeetrit (UV-1601 PC). FRAP-reaktiiv valmistati 300 mM atsetaatpuhvri (pH 3,6), 20 mM raud(III)kloriidi ja 10 mM 2,4,6-tris(2-püridüül)triasiini (TPTZ) (lahustatuna 40 mM HCl-is) segamisel vahekorras 10:1:1. Standardkõver genereeriti, kasutades standardina Troloxi (R²= 0,999) ja tulemused on väljendatud μM Troloxi/ml-na.
Töödeldud ja töötlemata mahlade antioksüdantset aktiivsust määrati DPPH meetodil, et hinnata nende võimet siduda DPPH vabu radikaale.31Kümme mikroliitrit mahla segati 1 ml DPPH lahusega (100 μM) metanoolis. Pärast 30-minutilist pimedas reageerimist mõõdeti segu neeldumist lainepikkusel 517 nm, kasutades Shimadzu UV-spektrofotomeetrit (UV-1601 PC). Tulemused väljendati troloksi ekvivalentidena (μM trolox/ml) kalibreerimiskõvera põhjal (R2= 0,990).
Saadud andmed näitasid, et NRC 620 austerservikutes täheldati maksimaalset lakaasi tootmist 18. käärimispäeva lõpuks, saavutades aktiivsuse 1302 U/l. See oli aluseks lakaasi tootmise optimaalse kultiveerimisaja määramiseks (joonis 1). Kuigi ensüümi tootmine suurenes kultiveerimisaja pikenedes, ei olnud suurenemise kiirus otseselt proportsionaalne kultiveerimisajaga; 21 päeva pärast oli ensüümi aktiivsus suurenenud vaid 90 U/l võrra (1390 U/l-ni). Seetõttu valiti optimaalseks kultiveerimisajaks lõpuks 18 päeva, et tasakaalustada toote saagikust kultiveerimisaja pikenemise majandusliku kasuga.
Kultiveerimisaja mõju lakaasi saagikusele Pleurotus ostreatus NRC 620-s. Kolm (12 mm) seeneniidistiku plokki inokuleeriti 50 ml steriilsesse söötmesse ja seejärel kultiveeriti erineva aja jooksul temperatuuril 28 °C.
Kooskõlas teiste uuringutega näitavad meie tulemused, et ideaalne kultiveerimisperiood seente laktaasi sekretsiooni tipptaseme saavutamiseks on tõenäoliselt 7–36 päeva.32Ezike jt sõnul.33*Trametes polyzona* WRF03 tootis üheksanda käärimispäeva lõpuks suurima koguse lakaasi, mille eriaktiivsus oli 1637 U/mg valku. Lisaks sellele tootsid Othman jt.34leiti, et *Trichoderma harzianum* S7113 eritas viiendal kultiveerimispäeval suures koguses lakaasi. Lakkaasi tootmiskiirus saavutas haripunkti neljateistkümnendal päeval ja seejärel järk-järgult vähenes.34Kuigi ensüümide sekretsioon võib toimuda ka peamise kasvufaasi ajal, saavutab see tavaliselt haripunkti vahefaasis ja selle käivitab süsiniku- või lämmastikuallika tarbimine.34,35
Kuigi Pleurotus ostreatus NRC 620 lakaas näitas kõrget aktiivsust laias temperatuurivahemikus 50 °C kuni 80 °C, lähenedes maksimaalsele aktiivsusele (69–98%), täheldati selle maksimaalset aktiivsust temperatuuril 70 °C (joonis 2a). Väljaspool seda temperatuurivahemikku vähenes ensüümi aktiivsus umbes 70 °C juures. Need tulemused viitavad sellele, et ensüüm on aktiivne kõrgetel temperatuuridel, tõenäoliselt seetõttu, et kõrge temperatuur suurendab reaktsiooni kineetilist energiat.
Reaktsioonitemperatuuri (a) ja pH (b) mõju lakaasi aktiivsusele *Pleurotus ostreatus* NRC 620-s. Temperatuurivahemik 20–90 °C saavutati segu eelinkubeerimisega erinevatel temperatuuridel 5 minutit enne ensüümi lisamist ja reaktsiooni alustamist. pH mõju lakaasi aktiivsusele hinnati, kasutades substraadina ABTS-i lahustes, mis sisaldasid 0,1 M tsitraat-fosfaatpuhvrit pH vahemikus 2,5–7,0.
Ezike jt sõnulal.33*Trametes polyzona* WRF03 lakaasi optimaalne temperatuur on 55 °C, mis on sama mis *Ganoderma lucidum* puhul.lakaas36ja sarnane *Trametes polyzona* KU-RNW02737 optimaalsele temperatuurile (50 °C)lakaas . Baldrian38märgib, et nagu ka teiste ligniini lagundavate ensüümsüsteemide puhul, on lakaasi ideaalne temperatuurivahemik 50–70 °C.
Tulemused näitasid, et ensüümi aktiivsus oli kõrgeim pH väärtusel 3,0, ulatudes 94% aktiivsuseni pH väärtusel 3,5. See jäi aga aktiivseks laias pH vahemikus 2,5–7,0 (joonis 2b). Lisaks näitas see suuremat aktiivsust happelistes tingimustes võrreldes neutraalsete või aluseliste keskkondadega. Selle aktiivsus püsis pH vahemikus 2,5–4,5 vähemalt 77%, kuid saavutas pH väärtusel 7,0 vaid umbes 38%. *Trametes polyzona* WRF03 lakaasi optimaalne pH oli 4,533, mis on sama kui *Trametes polyzona* KU-RNW02737, *Trichoderma harzanium* 39, *Pleurotus* sp. 40 ja *Trametes hirsuta* 41 lakaaside pH. Chairini jt uuringu kohaselt...42*Polymorpha f. sp.* WR710-1 lakaasi optimaalne pH on 2,2, samas kui *Polymorpha f. sp.* IBL-04 lakaasi optimaalne pH on 5,043. Hüdroksiidioonide (lakaasi inhibiitori) seondumine T2/T3 lakaasi vase aatomitega võib olla põhjuseks lakaasi aktiivsuse vähenemisele neutraalsetes või aluselistes pH tingimustes. See võib häirida sisemist elektronide ülekannet T1 tsentrist T2/T3 tsentrisse, seeläbipiiravensüümi aktiivsus23,44
Ensüümi inkubeerimisel erinevatel temperatuuridel leiti, et nii inkubatsiooniaeg kui ka temperatuur mõjutasid ensüümi stabiilsust. Tähelepanuväärselt näitas *Trametes polyzona* NRC 620 lakaas suuremat stabiilsust temperatuuridel 40 ℃ ja 50 ℃, säilitades 120 minuti pärast vastavalt 68,33% ja 59,61% oma esialgsest aktiivsusest (joonis 3a). Seevastu samades tingimustes (40 ℃ ja 50 ℃, 120 minutit) säilitas *Trametes polyzona* WRF03 lakaas vastavalt 64,38% ja 42,92% oma aktiivsusest.33Seevastu inkubatsiooniaja ja temperatuuri suurendamine vähendas *Trametes polyzona* NRC 620 lakaasi stabiilsust; pärast 60-minutilist inkubeerimist temperatuuril 60 ℃ ja 70 ℃ vähenes selle aktiivsus vastavalt 39,24% ja 1,72%-ni (joonis 3a). Kooskõlas eksperimentaalsete tulemustega näitas *Trametes polyzona* WRF03 lakaas kogu termilise töötlemise protsessi jooksul suuremat stabiilsust temperatuuridel 40 ja 50 ℃.33Samamoodi Lueangjaroenkit jt.al.37ja Chairin jtal.42teatas Trametes polyzona KURNW027 ja Trametes polyzona WR710-1 lakaaside stabiilsusest vastavalt temperatuuril 50 °C 1 tunni jooksul. Lakkaasina, mis on kasulik biokatalüsaator ja mida saab rakendada erinevates biotehnoloogia valdkondades, peaks sellel olema hea stabiilsus ja toimivus laias temperatuurivahemikus.
*Pleurotus ostreatus* NRC 620 lakaasi termostaatiline stabiilsus (a) ja pH stabiilsus (b). Termostaatilist stabiilsust hinnati ensüümilahuse inkubeerimisel 0,05 M naatriumfosfaatpuhvris (pH 7,0) vastavalt temperatuuril 40, 50, 60 ja 70 °C 2 tundi. pH stabiilsust hinnati ensüümilahuse inkubeerimisel 0,1 M tsitraatpuhvris ja Tris-puhvris (pH 3, 4, 6 ja 7) temperatuuril 40 °C 2 tundi. Jääkaktiivsus arvutati, kasutades substraadina ABTS-i pärast inkubeerimist.
Ensüümi kasutamise ja säilitamise optimaalsete tingimuste kindlaksmääramiseks uurisime pH mõju lakaasi stabiilsusele. Erinevate pH väärtustega kokkupuude mõjutas oluliselt valgu struktuuri stabiilsust, mõjutades seeläbi ensüümimolekuli stabiilsust ja aktiivsust. Tulemused näitasid, et ensüüm oli happelistes tingimustes vähem stabiilne, samas kui see näitas paremat stabiilsust kõrgematel pH väärtustel (neutraalsed ja aluselised piirkonnad). pH väärtustel 7,0, 6,0, 4,0 ja 3,0 olid ensüümi retentsioonimäärad 120 minuti pärast vastavalt ligikaudu 100%, 62,54%, 52,39% ja 11,14% (joonis 3b). *Strombus multisus* WRF03 lakaas näitas suuremat stabiilsust neutraalsetel pH väärtustel (5,5–6,5) ja madalamat stabiilsust happelistel pH väärtustel (alla 4,0). Pärast 120 minutit pH väärtustel 5,5, 6,0 ja 6,5 olid ensüümi retentsioonimäärad vastavalt ligikaudu 82%, 100% ja 93%.33Khairin jt.42märkisid, et Trametes polyzona WR710-1 lakaas oli stabiilne pH vahemikus 6,0 kuni 7,0, samas kui Sayed jt.45näitas, et lakaas oli stabiilsem neutraalse pH tingimustes. Siiski näitas Cerrena unicolori lakaas stabiilsust ka aluselistes tingimustes (pH 9,0).46Uuritud lakaasid näitasid suurt stabiilsust laias pH vahemikus. See võib olla oluline omadus tööstuslike rakenduste jaoks.
Kuna mõnel metalliioonil on ensüümi aktiivsusele nii stimuleeriv kui ka pärssiv toime, tuleb tööstuslikes rakendustes arvestada nende mõju ensüümi aktiivsusele. See on ülioluline, kuna metalliioonid on tavalised keskkonnasaasteained, mis võivad mõjutada rakuväliste ensüümide stabiilsust ja sünteesi.47Mitme metalliiooni mõju uurimiseks *Pleurotus ostreatus* NRC 620 lakaasile viisime läbi vastavad katsed. Nagu joonisel 4 näidatud, mõjutas metalliioonide kontsentratsiooni suurendamine 2,5 mM-lt 10 mM-le ensüümi funktsiooni negatiivselt, olenevalt kasutatud metalli tüübist. Näiteks,Mg²⁺ , Co²⁺ , Zn²⁺jaCu²⁺võib stimuleerida ja aktiveerida ensüümi aktiivsust, samal ajal kuiNa⁺ , Mn²⁺ , Ca²⁺jaK⁺võis ensüümi aktiivsust pärssida. 10 mM kontsentratsioonil olid Cu²⁺ ja Mg²⁺ ioonid *Pleurotus ostreatus* NRC 620 lakaasi aktiivsuse kõige tugevamad aktivaatorid, andes vastavalt ligikaudu 34% ja 20% aktivatsiooniastme. 10 mM kontsentratsioonil olid aga Ca²⁺ ioonid lakaasi kõige tugevamad inhibiitorid, vähendades ensüümi aktiivsust ligikaudu 60%.
Metalliioonide mõju Pleurotus ostreatus NRC 620 lakaasi aktiivsusele. Lakkaasi inkubeeriti 10 minutit naatriumfosfaatpuhvris (0,05 M, pH 7,0), mis sisaldas erinevaid metalliioone kontsentratsioonides 2,5 mM ja 10 mM. Seejärel käivitati reaktsioon substraadi (ABTS) lisamisega, mille järel mõõdeti suhtelist aktiivsust.
Meie tulemused on kooskõlas teiste autorite tulemustega, kes leidsid, et Mg²⁺ ja Cu²⁺ suurendavad *Trametes polyzona* WRF03³ aktiivsust. Castaño jt⁴⁸ leidsid, et *Xylaria* sp. lakaasi stimuleerivad teatud määral vaseioonid (Cu²⁺). Lisaks sellele viisid Foroutanfar jt⁴⁹ ja Si jt⁵⁰ läbi sarnaseid uuringuid vastavalt *Paraconiothyrium variabile* ja *Trametes pubescens* lakaasidega. Selle ensüümi II tüüpi vase sidumissait (T2) võib antud kontsentratsioonil küllastuda Cu²⁺-ga, mis võib selgitada lakaasi aktiivsuse stimuleerimist kõrgematel Cu²⁺³⁹ kontsentratsioonidel. Kuna valgemädaniku seente lakaasid on oksüdaasid, mis sisaldavad mitut vase aatomit, on vaseioonide mõju lakaasi aktiivsusele mitmekesine ja ulatub stimuleerivast ja inhibeerivast kuni neutraalse toimeni.⁵¹ Seevastu Zhou jt[52]teatas, etCu²⁺pärssis Taiwani maa-aluse termiidi (Odontotermes formosanus) lakaasi aktiivsust. Cerena sp. HYB07 lakaasid aga[53]ja Clitocybe maxima[54]vaseioonid ei mõjutanud.
Substraadi spetsiifilisust väljendati selle kineetiliste parameetritega (Km ja Vmax); mida tugevam on substraadi seondumisafiinsus ensüümiga, seda madalam on Km väärtus ja seda kõrgem on substraadi spetsiifilisus.3, 21, 55*Pleurotus ostreatus* NRC 620 lakaasi kineetilised parameetrid (Km ja Vmax) määrati GraphPad Prism 6.0 tarkvara abil, joonistades Lineweaver-Burki graafiku (joonis 5). ABTS-i substraadina kasutamisel olid tulemused 1,99 mM ja 16217 μmol.min⁻¹ L⁻¹,vastavalt Elsayed jt.21teatas, et ABTS oksüdatsiooni Km väärtused olid vastavalt 0,1 mM ja 0,064 mM, mis näitab Lac A ja Lac B isoensüümide suurt afiinsust ABTS suhtes. Lisaks olid Vmax väärtused 0,182 μmol.min⁻¹ja 0,603 μmolmin⁻¹vastavalt. Saadud Km väärtus oli madalam kui Trametes polyzona WRF03-l (8,66 mM); lisaks oli ka nende Vmax väärtus (1429 mmol/min)madalamkui substraadina kasutati ABTS-i.33 Samamoodi olid Lentinus squarrosulus MR13 ja Trametes sp. AH28-2 lakaasi kontsentratsioonide Km väärtused vastavalt 0,0714 mM ja 0,025 mM ning Vmax väärtused olid 0,0091 mM min−1 ja 0,67 mM min−1 mg−1 (ABTS-i suhtes).vastavalt.56,57
Uuriti ABTS kontsentratsiooni mõju *Pleurotus ostreatus* NRC 620 lakaasi aktiivsusele ning joonistati Lineweaver-Burki graafik, mis kujutab algse reaktsioonikiiruse pöördväärtust ABTS kontsentratsiooni suhtes. Kineetiliste parameetrite (Vmax ja Km) määramiseks mõõdeti ABTS oksüdatsioonireaktsiooni erinevate lakaasi kontsentratsioonidega (0,025–3,0 mM) pH väärtusel 4,5. Michaelis-Menteni kineetilised konstandid arvutati Lineweaver-Burki graafiku abil, mis kujutab reaktsioonikiiruse pöördväärtust substraadi kontsentratsiooni suhtes. Kineetilised konstandid arvutati Lineweaver-Burki graafikult, kasutades GraphPad Prism 6.01 tarkvara.
Traditsioonilised selitavad ensüümid, näiteks pektinaasid, hüdrolüüsivad pektiinaineid, vähendades viskoossust ja hägusust. Need lagundavad tõhusalt struktuurseid polüsahhariide ja neid kasutatakse saagise ja selguse parandamiseks sageli koos teiste ensüümidega, näiteks tsellulaaside ja hemitsellulaasidega. Pektinaasid ei ole aga spetsiifiliselt suunatud fenoolsetele ühenditele, mis on hägususe ja oksüdatiivse pruunistumise peamised põhjustajad, eriti mahlades, näiteks õuna- ja viinamarjamahlas.58Seevastu lakaasid katalüüsivad fenoolsete ühendite oksüdeerumist, polümeriseerides need suuremateks lahustumatuteks molekulideks, mida saab setitamise või filtreerimise teel eemaldada. See mehhanism mitte ainult ei paranda selgust, vaid pikendab ka mahla säilivusaega, vähendades fenoolsete ühendite põhjustatud oksüdatiivse pruunistumise tõenäosust. Lisaks saab lakaasipõhiseid selitusprotsesse läbi viia leebetes töötlemistingimustes (pH 3,5–5,5, temperatuur 25–40 °C), mistõttu sobivad need õrnade mahlade valmistamiseks, ilma et see kahjustaks nende toiteväärtust või organoleptilisi omadusi.59Uuringud on näidanud, et pektinaasiga töötlemine võib mahla selitada 1–2 tunniga, samas kui lakaasiga töötlemine nõuab fenoolsete ühendite täielikuks redutseerimiseks tavaliselt pikemat reaktsiooniaega (3–6 tundi). Seda protsessi saab aga optimeerida ensüümi immobiliseerimise või lakaasi kombineerimise teel mehaaniliste selitusmeetoditega.60Selles uuringus näitas toorekstrakti ensüümiline profiilimine märkimisväärset lakaasi ja α-amülaasi aktiivsust, samas kui pektinaasi ja ksülanaasi aktiivsus oli äärmiselt madal ning tsellulaasi aktiivsust ei tuvastatud. Seega oli hägususe ja fenoolisisalduse vähenemine peamiselt tingitud lakaasi toimest, samas kui viskoossuse muutus võis olla osaliselt tingitud amülaasi toimest.
Tabel 1 näitab värskelt pressitud õunamahla ja lakaasiga töödeldud proovide füüsikalis-keemilisi parameetreid. Tulemused näitasid, et värskelt pressitud õunamahla saagis (71,59%) oli madalam kui lakaasiga töödeldud proovidel (87,34%). Need tulemused on kooskõlas Pilniku ja Orange'i leidudega.61, kes märkisid, et ensüümide kasutamine puuviljade töötlemisel võib suurendada mahla saagikust, parandada filtreerimist ja saada kontsentreerimiseks kvaliteetset, selget mahla. Mahla saagikuse suurenemine tuleneb peamiselt mahla lahustuvate suhkrute sisalduse suurenemisest. Puuviljade ensümaatilise hüdrolüüsi käigus hävivad toote rakuseintes olevad mesoglea ja pektiin ning muunduvad lahustuvateks aineteks, näiteks neutraalseteks suhkruteks ja hapeteks.62.Ensüümidega töödeldud õunamahla pH väärtus oli oluliselt madalam kui kontrollrühmal (P < 0,05) ja mõlema rühma pH väärtus tõusis säilitamise ajal oluliselt (tabel 1). Need tulemused on kooskõlas Mark jt. tulemustega.63, kes märkisid, et india pähklimahla pH langes pärast kuumtöötlust säilitamisel. Pektiini lagunemine ja galakturoonhappe moodustumine pärast ensüümtöötlust võivad olla pH suurenemise põhjuseks säilitamise ajal. Ensüümidega töödeldud proovide pH püsis kogu säilitamise vältel vahemikus 4,05–4,31, samas kui töötlemata õunamahla pH oli vahemikus 4,12–4,33.
Nii töötlemata kui ka lakaasiga töödeldud proovide koguhappesus (TA) vähenes säilitusaja pikenedes (tabel 1). Happesuse langust seostati orgaaniliste hapete muundumisega süsivesikuteks või ensümaatiliste reaktsioonidega, samuti oksüdeerumisega mahla säilitamise ajal.64Kontrollproovis oleva õunamahla ja ensüümidega töödeldud proovide koguhappesus oli madalam kui teistel mahladel (maasikamahl 0,9%, ploomimahl 2,2%, kumkvatimahl 1,0%, aprikoosimahl 2,4%, apelsinimahl 0,8%), kuid sarnane teiste mahlade omaga (nt pirnimahl 0,3%).62Need erinevused töötlemata värskelt pressitud õunamahlas võivad tuleneda erinevatest teguritest, nagu kasvutingimused, geneetilised tegurid, küpsusaste ja töötlemismeetodid.65Kontroll- ja lakaasiga töödeldud õunamahla üldhappesuse vähenemine on kooskõlas Singhi jt esitatud tulemustega.66Jin Nuo õunamahla koguhappesuse vähenemise kohta pärast 74-päevast säilitamist. Teisest küljest, Oshmiansky ja Wojdylo67traditsiooniliste selitusmeetodite mõju uurimisel ei leidnud õunamahla happesuses olulisi muutusi.
Tabelis 1 esitatud tulemused näitavad, et lakaasiga töödeldud õunamahla lahustuvate kuivainete kogusisaldus (TSS) oli kõrgem kui töötlemata proovis. Need tulemused on kooskõlas avaldatud uuringutega.. 68Lisaks näitab tabel 1, et kontroll-õunamahla grupi TSS-väärtus oli alghetkel 9,58 ja säilitusperioodi lõpuks jõudis see 11,05-ni. Need väärtused on madalamad kui Hamidi jt poolt avaldatud värske õunamahla TSS-väärtused.. 69(Vastavalt 11,2 ja 11,80). Lakkaasiga töödeldud õunamahlaproovide TSS-väärtus suurenes märkimisväärselt, alustades 11,23-st ja jõudes pärast kahenädalast säilitamist temperatuuril 4 °C 12,93-ni (tabel 1). Sarnast TSS-i suurenemist säilitamise ajal täheldati ka tsitrusviljade, sidrunite ja magusate apelsinide puhul. Lahustuvate kuivainete koguhulga (TSS) suurenemine säilitamise ajal võib olla tingitud polüsahhariidide (tärklise) hüdrolüüsist monosahhariidideks (suhkruteks), kontsentratsiooni suurenemisest mahla dehüdratsiooni tõttu ja pektiini lagunemisest mahlas lahustuvateks kuivaineteks. Lahustuvate kuivainete koguhulga (TSS) suurenemine on tõenäoliselt tingitud lahustuvate suhkrute suurenemisest, mis võivad tekkida pektiini või tselluloosi muundamisel lahustuvateks suhkruteks vastavalt pektiini või tsellulaasi toimel või tärklise hüdrolüüsil suhkruteks, nagu on teatanud Hamed jt.69.Lakkaasi mõju õunamahla omadustele on visuaalselt jälgitav, kuna lakaasiga töödeldud õunamahlal on parem voolavus ja madalam viskoossus kui töötlemata mahlal. See tähelepanek on esitatud tabelis 1; ensüümiga töödeldud proovi viskoossus oli 1,87 cP, kontrollproovi viskoossus aga 2,95 cP. See viskoossuse oluline langus on tõenäoliselt tingitud pektiinitaoliste ainete suuremast veesidumisvõimest ja kohesiivse võrgustiku struktuuri moodustumisest.
Selles uuringus uuriti lakaasi mõju õunamahla pruunistumisindeksile (BI), mõõtes spektrofotomeetriga neeldumist lainepikkusel 420 nm. Tulemused on esitatud tabelis 1. Säilitamise ajal näitas nii töödeldud kui ka töötlemata rühmade õunamahlaproovide BI järkjärgulist tõusutrendi. BI peegeldab pruunistumisastet ja seda saab kasutada ...olulineensümaatiliste ja mitteensümaatiliste pruunistumisreaktsioonide indikaator. Neelduvus suurenes säilitamise ajal märkimisväärselt (P < 0,05). Säilitamise lõpus oliA420Õunamahlaproovide väärtus kontroll- ja ensüümidega töödeldud rühmas suurenes vastavalt umbes 217% ja 121% (tabel 1). Tulemused näitavad, et ensüümtöötlus suudab pruunistumisastet tõhusalt vähendada umbes 56%. Bezerra jt tulemused...[19]] on meie tulemustega kooskõlas; Nad kasutasid õunamahla selitamiseks lakaasi-glutaraldehüüdi-kookoskiudu, vähendades selle algset värvust 61%.
Kuigi puuviljamahlades sisalduvatel polüfenoolidel on inimkehale positiivne toitumisalane ja terapeutiline mõju, võivad nad reageerida ka valkudega, põhjustades mahla hägusust, settimist või sogasust, muutes seeläbi toote maitset ja aroomi ning lühendades selle säilivusaega.71Selle uuringu eesmärk oli ohutult vähendada õunamahla fenoolsete ühendite sisaldust, kasutades Pleurotus ostreatus NRC 620 lakaasi. Tabelis 1 esitatud tulemused näitavad, et lakaasiga töödeldud õunamahla fenoolsete ühendite kogusisaldus vähenes enne 4 °C juures säilitamist oluliselt. Lisaks vähenes fenoolsete ühendite kogusisaldus mõlemas uuritud proovis ka säilitamise ajal (tabel 1). Sandri jt uuring.72näitas, et ensüümidega töödeldud õunamahl säilitab oma antioksüdantse aktiivsuse ja fenoolsete ühendite sisalduse. Lettera jt uuringu tulemused aga...73näitavad, et apelsinimahla töötlemine seenlakaasiga võib vähendada selles sisalduvate fenoolsete ühendite sisaldust kuni 45%.
Fenoolsetel ühenditel on näidatud olevat sellised omadused nagu vabade radikaalide püüdmine, singletse hapniku redutseerimine ja kustutamine, vesinikuaatomi ülekanne ja elektronide annetamine vabadele radikaalidele, mis muudab need tugevateks antioksüdantideks.74Seetõttu kasutati käesolevas uuringus DPPH- ja FRAP-põhiseid meetodeid, et hinnata lakaasi mõju 14 päeva külmkapis hoitud õunamahla antioksüdantsele aktiivsusele (tabel 2). Mõlemad meetodid näitasid antioksüdantse aktiivsuse suurenemist säilitamise ajal, mis võib olla tingitud vabade fenoolsete ühendite hulga suurenemisest või Maillardi reaktsioonisaaduste (MRP-de) moodustumisest, kusjuures Maillardi reaktsioonisaadused on tõenäoliselt antioksüdantse aktiivsuse suurenemise põhjuseks.75Mitteensümaatilised pruunistumisreaktsioonid (sh askorbiinhappe lagunemine, Maillardi reaktsioonid ja suhkrute happekatalüüsitud lagunemine) tekitavad pruune pigmente (melanoidiine). Vahepealsed askorbiinhappe lagunemisproduktid ja suhkrute lagunemisproduktid (näiteks karbonüülühendid) võivad Maillardi reaktsioonide kaudu reageerida aminohapetega.76Kuigi puu- ja köögiviljade pruunistumist ladustamise ajal on põhjalikult uuritud, on meie arusaam nendest reaktsioonidest endiselt piiratud.77Võrreldes FRAP-meetodiga näitas lakaasiga töödeldud õunamahl DPPH meetodil oluliselt madalamat antioksüdantset aktiivsust (tabel 2) ning kõigi proovide antioksüdantne aktiivsus suurenes oluliselt säilitusaja pikenedes. Käesolevas uuringus kasutati antioksüdantse aktiivsuse määramiseks kahte erinevat meetodit, kuna nende põhimõtted erinevad. DPPH meetod mõõdab võimet neutraliseerida vabu radikaale, FRAP meetod aga võimet redutseerida rauaioone. Seetõttu on uuritud proovide antioksüdantse aktiivsuse paremaks mõistmiseks soovitatav kasutada antioksüdantse aktiivsuse määramiseks mitut meetodit.78
Selle uuringu üks põhijäreldusi on see, et *Pleurotus ostreatus* lakaas NRC 620 omab optimaalset aktiivsust temperatuuril 70 °C ja pH väärtusel 3,0. Võrreldes teiste mahla selitamiseks tavaliselt kasutatavate seenlakaasidega, näiteks *Trametes versicolor* ja *Ganoderma lucidum* lakaasidega, on *P. ostreatus* NRC 620-l suurem termiline stabiilsus ja happelisem pH. *Trametes versicolor* ja *Ganoderma lucidum* lakaasid omavad tavaliselt optimaalset aktiivsust temperatuurivahemikus 50–60 °C ja pH väärtustel 3,5–5,0. See erinevus võib aidata kaasa mahla selitamise efektiivsuse paranemisele, eriti happeliste mahlade puhul, kus stabiilsus madalamatel pH väärtustel on kriitilise tähtsusega. *P. ainulaadne omadus. Võrreldes teiste uuritud seenlakaasidega on *Pleurotus ostreatus* NRC 620-l võime tõhusalt toimida ka keerulisemates tingimustes. Selle kõrgem optimaalne aktiivsustemperatuur viitab potentsiaalsetele eelistele tööstuslikes rakendustes, näiteks kiiremale reaktsioonikiirusele ja väiksemale mikroobsele saastumisele. Selle madal pH, mis sobib hästi paljude mahlade happelise olemusega, võib olla kasulik mahla selitamisprotsessides. Need tulemused õigustavad edasist uurimist laiaulatuslikuks kasutamiseks, muutes *Pleurotus ostreatus* NRC 620 elujõuliseks alternatiiviks traditsioonilistele seenlakaasi allikatele. Võrreldes varasemate uuringutega leidsime, et optimaalne temperatuur on 60 °C ja optimaalne pH on 3,0. Pärast 80-minutilist reaktsiooni temperatuuril 60 °C säilitas *Ganoderma lucidum* lakaas46% oma tegevusest.79 Kurniawati ja Nicelle'i andmetel80*Ganoderma lucidum* ensüümid omavad suurepärast kuni mõõdukat stabiilsust temperatuuril 25 °C ja pH väärtuste vahemikus 5,0–8,0 ning stabiilsust pH väärtusel 6,0 ja temperatuuridel 10–30 °C. Käesolevas uuringus leidsime, et *Pleurotus ostreatus* ensüümi aktiivsuse optimaalne pH ja temperatuur olid vastavalt 3,0 ja 70 °C. Pärast kahetunnist inkubeerimist temperatuuril 40 °C ja 50 °C säilitas ensüüm vastavalt 68,33% ja 59,61% oma aktiivsusest. Lisaks näitas Pleurotus ostreatus NRC 620 lakaas suurt aktiivsust laias temperatuurivahemikus 50 °C kuni 80 °C, saavutades peaaegu maksimaalse aktiivsuse (69%–98%), kusjuures maksimaalset aktiivsust täheldati temperatuuril 70 °C.
Kokkuvõtteks võib öelda, et staatilistes tingimustes saadud austerserviku lakaas NRC620 näitas optimaalset aktiivsust ja stabiilsust erinevates pH ja temperatuuritingimustes, näidates üles paremat stabiilsust võrreldes teiste ensüümiallikatega. 10 mM MgSO₄ ja CuSO₄ lisamine suurendas ensüümi aktiivsust vastavalt ligikaudu 21% ja 35%. Õunamahlaks töödeldes vähendas ensüüm pH-d ja viskoossust, samas kui fenoolide sisaldus vähenes säilitamise ajal vaid veidi.
Tulemused kinnitavad lakaasi potentsiaali toiduainetööstuses, eriti jookide selitamisel. Fenoolsete ühendite spetsiifilise lagundamise abil vähendab lakaas mitte ainult hägusust ja parandab selgust, vaid säilitab ka puuviljamahlade kvaliteedi pehmetes töötingimustes. Erinevalt traditsioonilistest selitusainetest nagu želatiin, bentoniit ja silikageel ei tekita lakaas jäätmeid ega eemalda jookidest meeldivaid aroome, mistõttu on see keskkonnasõbralikum ja jätkusuutlikum valik. Lisaks pakub lakaas võrreldes teiste ensüümide ja filtreerimismeetoditega sihipärast ja kulutõhusat lahendust, ilma et see kahjustaks toote kvaliteeti.
Kyomuhimbo, HD ja Brink, HG. Vase sisaldavate lakaaside rakendused ja immobiliseerimisstrateegiad; ülevaade. Heliyon 9, e13156 (2023).
Postituse aeg: 15. detsember 2025